Eine vergleichende Studie unter Verwendung der Reaktionsoberflächenmethodik und eines künstlichen neuronalen Netzwerks zur optimierten Melaninproduktion durch Aureobasidium pullulans AKW

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13545 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Wirkung von drei unabhängigen Variablen (d. h. Tyrosin, Saccharose und Inkubationszeit) auf die Melaninproduktion von Aureobasidium pullulans AKW wurde durch zwei unterschiedliche Ansätze entschlüsselt: Reaktionsoberflächenmethodik (d. h. Box-Behnken-Design (BBD)) und künstliches neuronales Netzwerk (ANN). In dieser Studie wurde zum ersten Mal überhaupt ein einfaches Medium verwendet. Bezüglich des Mindesthaltbarkeitsdatums hatten Saccharose und Inkubationsintervalle einen signifikanten Einfluss auf die Produktion (Melaninspiegel), Tyrosin jedoch nicht. Der Validierungsprozess zeigte eine hohe Übereinstimmung der BBD- und ANN-Paradigmen mit der experimentellen Melaninproduktion. Bezüglich ANN waren die vorhergesagten Melaninwerte in hohem Maße mit den experimentellen Werten vergleichbar, wobei geringfügige Fehler mit BBD konkurrierten. Sehr vergleichbare experimentelle Melaninwerte wurden bei Verwendung von BBD (9,295 ± 0,556 g/L) und ANN (10,192 ± 0,782 g/L) erzielt. ANN hat die Melaninproduktion genau vorhergesagt und zeigte eine um etwa 9,7 % höhere Verbesserung der Melaninproduktion als BBD. Die gereinigte Melaninstruktur wurde durch Rasterelektronenmikroskopie (REM), energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX), Röntgenbeugungsmuster (XRD) und thermogravimetrische Analyse (TGA) verifiziert. Die Ergebnisse bestätigten die hierarchische Architektur der Partikel als kleine Kompasse durch SEM-Analyse, den Zwischenschichtabstand in der XRD-Analyse, den maximalen Atomprozentsatz für Kohlenstoff- und Sauerstoffatome in der EDX-Analyse und die große thermische Stabilität in der TGA-Analyse gereinigtes Melanin. Interessanterweise war der aktuelle neuartige endophytische Stamm Tyrosin-unabhängig und das einzigartig angewandte ANN-Paradigma war effizienter bei der Modellierung der Melaninproduktion mit höherer Menge auf einem einfachen Medium in relativ kurzer Zeit (168 Stunden), was zusätzliche Optimierungsstudien zur weiteren Maximierung nahelegt der Melaninproduktion.

Das Interesse an natürlichen Pigmenten, insbesondere solchen aus Mikroorganismen, hat Verbraucher geweckt, da die Verbreitung synthetischer Farbstoffe in Kosmetika, der Lebensmittelverarbeitung, Textilien und Pharmazeutika aufgrund ihrer Karzinogenität, Hyperallergenität und Toxigenität begrenzt ist1,2. Der Wert mikrobieller Pigmente liegt in ihrer hohen Stabilität, Ausbeute und einfachen Herstellung sowie in ihren geringen Kosten und der einfachen mikrobiellen Kultivierung3. Die mikrobielle Melaninproduktion ist ein interessantes Forschungsgebiet, da die Industrie immer mehr nach natürlichen Pigmenten als sicheren, leicht abbaubaren und umweltfreundlichen Produkten verlangt1.

Melanin ist ein dunkelbraunes Pigment, das durch die oxidative Polymerisation von Phenolverbindungen wie Glutaminyl-3,4-dihydroxybenzol, Catechol, 3,4-Dihydroxynaphthalin oder 3,4-Dihydroxyphenylalanin während der Stoffwechselwege von gebildet wird Bei Pilzen ist ein anderer Weg der 3,4-Dihydroxyphenylalanin-Weg, bei dem Tyrosin durch Tyrosinase und Laccase katalysiert wird, um Dopaquinon zu bilden, das oxidiert und automatisch zu Melanin polymerisiert wird3,4. Darüber hinaus hängt die Melaninproduktion von intra- und/oder extrazellulären Tyrosinase-Enzymen ab, durch die in mehreren Studien der kinetische Prozess der Aktivierung, Inaktivierung, Induktion und Inhibition des Tyrosinase-Enzyms während des Wachstums von Penicillium chrysogenium, Trichderma reesei und Trichoderma harzianum ermittelt wurde2,5.

Unter den mikrobiellen Melaninproduzenten sind Pilze bei der Melaninbildung überlegen und stehen als wirksame Quelle zur Verfügung, da sie in der Lage sind, eine hohe Ausbeute der Substanz im kostengünstigen Kulturmedium zu produzieren, wodurch der Bioprozess im industriellen Maßstab wirtschaftlich machbar wird3 ,4. Es wurde berichtet, dass mehrere askomycetische Pilze Melanin produzieren, z. B. Aureobasidium pullulans, Neophaeotheca triangularis, Trimmatostroma salinum und Hortaea werneckii6,7. Im Vergleich zu Bakterien haben diese Pilze potenzielle Vorteile, da zwei Schlüsselenzyme (Tyrosinase und Laccase) vorherrschen, die eine wichtige Rolle bei der Melaninproduktion spielen8.

Ein weiterer jungfräulicher Bereich von Mikroorganismen musste für die Melaninproduktion untersucht und erforscht werden, nämlich die endophytischen Mikroben, die bei der Produktion einzigartiger Biomoleküle in geschätzten Mengen effizienter sind. Unter Endophyten versteht man mikrobielle Gemeinschaften, die in Pflanzengeweben leben und wachsen, ohne dem Wirt Schaden zuzufügen9.

Melanin hat mehrere mögliche Anwendungen im medizinischen Bereich, z. B. als antimikrobielle, antivirale, antioxidative, antitumorale und entzündungshemmende Wirkung, sowie in der Kosmetik als Schutzmittel für Haut und Augen3,10 und zur biologischen Sanierung stark verschmutzter Stellen in der Umwelt Metalle11. Aufgrund dieser Melaninvorteile in einer Vielzahl von Anwendungen besteht eine wachsende Nachfrage nach einer kostengünstigen Melaninproduktion. Durch ein neues Optimierungskonzept12 könnte der Bioproduktionsprozess deutlich reduziert werden.

Die Response-Surface-Methodik (RSM) ist ein multivariates statistisches Design, das zur Bewertung der Auswirkungen von Faktoren, zur Konstruktion von Modellen und zur Vorhersage optimaler Bedingungen mit der minimalen Anzahl von Durchläufen angewendet wird9,13,14. RSM ist eine statistische Technik, die die Korrelation zwischen mehreren unabhängigen Variablen und der Reaktion von Bioprozessen modelliert. Es wird üblicherweise zur Optimierung der Bioprozessleistung eingesetzt, indem die optimalen Einstellungen für eine Reihe von Variablen ermittelt werden, die die Reaktion beeinflussen. RSM ist eine effiziente Methode für die Gestaltung und Analyse von Experimenten zur Optimierung der Bioprozessleistung. Dies wiederum ermöglicht die Bestimmung einer starken Stelle, an der die Parameter den höchsten Ertrag und die niedrigsten möglichen Betriebsparameter und Fehler erzielen können9,13.

Central Composite Designs (CCD) und BBD sind beides RSM, die zur Anpassung eines vollständigen quadratischen Modells verwendet werden können. BBD wurde ausgewählt, weil es keine axialen Punkte umfasst, die sich außerhalb des Würfels des Designraums befinden, um die Krümmung der Reaktionsfläche abzuschätzen. Daher hat BBD im Vergleich zu CCD weniger Designprobleme und spart Zeit und Geld. Diese Punkte sind nicht erforderlich, wenn sich die interessierende Region gut verhält, wie es in unserer Studie hier der Fall ist. Aus dem gleichen Grund ist die Durchführung von BBD sicher, da es keine extremen Läufe gibt und die Faktoren bei ihren getesteten Grenzen eine gute Leistung erbringen. Aufgrund der drehbaren Natur von BBD ist es robuster gegenüber Rauschen, was bedeutet, dass es nicht auf die Reihenfolge der Versuchsläufe anspricht, d. h. das Design muss nicht in einer bestimmten Reihenfolge ausgeführt werden15,16,17.

Bei der BBD geht es darum, die Eingabevariablen (Faktoren) innerhalb bestimmter vorgegebener Bereiche und Niveaus zu variieren, was eine effiziente Ressourcennutzung und eine Reduzierung der Versuchsdurchläufe ermöglicht18. Das Design kann auch nützlich sein, um die Wechselwirkungen zwischen Variablen zu untersuchen und die optimale Kombination von Variablen zu identifizieren, die die Antwortvariable maximiert19. Die Durchsicht der Literatur enthält eine Fülle von Berichten, die das Potenzial von RSM, insbesondere der BBD, bei der Optimierung zahlreicher Bioprodukte wie Enzyme (α-Amylase15, β-Xylanase20, Pektin-Oligosaccharid-Produktion21, biologischer Abbau von Antibiotika in der Umwelt17 usw.) hervorheben Monascus-Pigmentproduktion16 usw.

Bisher wurden keine Arbeiten zur Optimierung der Melaninproduktion mittels künstlicher Intelligenz durchgeführt. Ein künstliches neuronales Netzwerk (ANN) dient als Kernelement und eines der grundlegenden Werkzeuge beim maschinellen Lernen. ANN könnte als fortgeschrittene Erweiterung von RSM betrachtet werden und den auf Polynomregression basierenden Modellierungsansatz von RSM hervorragend ersetzen22,23,24. Wie das menschliche Gehirn ist ein KNN in der Lage, Daten anspruchsvoll zu analysieren und zu verarbeiten, indem es effizient Rechenmodelle mit vollständig verbundenen Knoten innerhalb der verborgenen Schicht(en) erstellt. Diese Art der Modellierung erleichtert das Erlernen von Datenmustern und ermöglicht dadurch eine genaue Entscheidungsfindung auf Basis historischer Daten. Beim Aufbau eines ANN-Modells wird zunächst die Netzwerkarchitektur ausgewählt, gefolgt von der Erstellung versteckter Schichten mit ausreichend Neuronen. Anschließend durchläuft das Netzwerk einen Lern- und Trainingsprozess, bis es das Datenmuster erfasst. Nach der Fertigstellung wird das resultierende ANN-Modell validiert und verifiziert, bevor es als Vorhersagemodell genehmigt wird. Das KNN-Paradigma basiert auf der Identifizierung verschiedener Muster in den Daten und der Erkennung etwaiger Unterschiede, um das Muster zu bestimmen, das das gewünschte Ergebnis erzielt. Dieser Prozess wird durch intelligente Backpropagation reguliert, die das gewünschte Ausgabemodell generiert, um das Ziel (Target) zu erreichen. Dieses Verfahren ist genauer und kann andere Modellierungsmethoden effektiv ersetzen22,25.

In dieser Studie wollten wir ein einfaches Medium entwickeln, das die Mindestanforderungen für die Melaninproduktion (dh Tyrosin und Saccharose zusätzlich zur Inkubationszeit) enthält. Der Grund für die Auswahl von Tyrosin liegt darin, dass die Biosynthese von Melanin von Tyrosin als Vorstufe für die Melaninproduktion abhängt3. Viele Kohlenstoffquellen könnten von Pilzen verstoffwechselt werden, aber keine dokumentierten Daten weisen auf die Rolle von Saccharose oder Kohlenstoffquellen bei der Melaninsynthese durch Pilze hin, sie können jedoch bei den meisten Pilzen an verschiedenen Stoffwechselprozessen für Energie und Wachstum beteiligt sein26. Dabei wurde Saccharose als leicht verfügbare und kostengünstige Kohlenstoffquelle ausgewählt. Die Fermentationszeit ist entscheidend für die Melaninproduktion, da sie die Dauer und das Ausmaß der Melaninsynthese bestimmt.

Obwohl die kommerzielle Produktion von Melanin mikrobiellen Ursprungs erhebliche Fortschritte gemacht hat27, gibt es immer noch Raum für Verbesserungen. Daher zielte unsere Studie darauf ab, die Melaninproduktion mithilfe einer Kombination aus BBD- und ANN-Methoden zu optimieren. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die das ANN-Verfahren nutzt, um die Melaninproduktion des endophytischen Pilzes A. pullulans zu steigern und gleichzeitig eine kostengünstige Mediumquelle zu nutzen.

Der Aureobasidium pullulans-Stamm AKW wurde in unserer vorherigen Studie isoliert und identifiziert28. Die Stammkultur wurde nach 5-tägiger Inkubation bei 30 °C unter dunklen Bedingungen auf Kartoffel-Dextrose-Agarplatten konserviert und in regelmäßigen Abständen subkultiviert. Zur Herstellung des Standardinokulums wurde A. pullulans AKW im gleichen Fermentationsmedium unter Schütteln (100 U/min, 30 °C, 72 h) gezüchtet, um eine Zellzahl von etwa 3 × 107 Zellen/ml zu erhalten.

Für den Melaninproduktionsprozess wurde ein einfaches Fermentationsmedium, nämlich Kartoffelsaccharosebrühe, verwendet. Das Medium wurde unter Verwendung von Kartoffelinfusion als Basis für das Fermentationsmedium hergestellt. Zur Zubereitung des Kartoffelaufgusses wurden 200 g geschnittene und ungeschälte Kartoffeln 30 Minuten lang in einem Liter destilliertem Wasser gekocht und dann filtriert, um Kartoffelrückstände zu entfernen. Dem Kartoffelaufguss wurden unterschiedliche Konzentrationen an Tyrosin (als Auslöser der Melaninproduktion) und Saccharose (als Kohlenstoffquelle) zugesetzt (Tabelle 1). Der pH-Wert des Mediums wurde auf 6,0 eingestellt. Portionen von 100 ml Medium wurden in Kanonkolben überführt und 15 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert. Das Medium wurde mit Pilzinokulum in einem Anteil von 5 % beimpft. Das beimpfte Kulturmedium wurde für verschiedene Zeiträume bei 30 °C und einer Rotationsgeschwindigkeit von 200 U/min inkubiert.

Das Protokoll von El-Gamal et al.29 und Müjdeci30 wurde mit geringfügigen Modifikationen für die Trennung und Reinigung von Melanin verwendet. Kurz gesagt, Melanin wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 3000 × g von den mikrobiellen Zellpellets abgetrennt. Das resultierende zellfreie Filtrat, das Melanin enthielt, wurde durch Senkung des pH-Werts auf 2,0 mit HCl (6 M) ausgefällt und 4 Stunden lang unter Kühlung aufbewahrt. Der Niederschlag wurde 15 Minuten lang bei 7000 × g zentrifugiert. Das ausgefallene Melanin wurde mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Vorgang wurde viermal wiederholt, um gereinigtes Melanin zu erhalten. Das gereinigte Pigment wurde nach der Lyophilisierung gelagert (bei –20 °C).

Ziel dieser Untersuchung war es, die beste Kombination der wichtigsten Faktoren, die die Melaninproduktion beeinflussen, auf einem einfachen Medium zu untersuchen. Die Studie geht davon aus, dass Tyrosin (der Vorläufer der Melaninproduktion), Saccharose (die häufigste Kohlenstoffquelle) und die Inkubationszeit wichtige Faktoren sind. Die drei unabhängigen Variablen wurden zur Maximierung der Melaninproduktion unter Verwendung des BBD von RSM31 optimiert. Basierend auf der BBD-Matrix wurden die unabhängigen Faktoren auf drei Ebenen (niedrig, mittel oder hoch) getestet. Dementsprechend wurden 15 Läufe generiert, die drei Mittelpunkte (mittlere Ebenen) enthalten. Tabelle 1 zeigt die experimentelle Designmatrix, die die verschiedenen Kombinationen der drei Variablen enthält. Jede Kombination wurde dreimal wiederholt. Bei der Durchführung der experimentellen Versuche wurde, wie bereits erwähnt, die Melaninproduktion als Zielreaktion auf die Drei-Faktoren-Matrix gemessen. Anschließend wurden die gesammelten Daten statistisch analysiert, um die Beziehung zwischen den drei unabhängigen Variablen und der Melaninproduktion herauszufinden und das optimale Niveau jedes Faktors vorherzusagen, die nächste Gleichung. (1) wurde angewendet:

Dabei ist Y die prognostizierte Melaninproduktion, β0 die Modellkonstante, βi der lineare Koeffizient, βij der Kreuzproduktkoeffizient, βii der quadratische Koeffizient und Xi und Xj die unabhängigen Variablen.

Die Gleichung wurde verwendet, um den Zusammenhang zwischen unabhängigen Variablen und der Melaninproduktion herauszufinden und die optimale Konzentration jedes Faktors vorherzusagen. Die Varianzanalyse (ANOVA) und das Bestimmtheitsmaß (R2) wurden durchgeführt, um die Signifikanz der Variablen zu bestimmen und die Güte des Modells sicherzustellen. Darüber hinaus wurde die BBD-Präzision visuell beurteilt, indem die vorhergesagten Werte mit den tatsächlichen Werten verglichen und die Verteilung der Datenpunkte untersucht wurden.

Die aus der BBD-Matrix erhaltenen Daten wurden zur Entwicklung eines Vorhersagemodells mit maschinellem Lernen verwendet. Das ANN-Modell wurde durch das Training eines vollständig verbundenen ANN mit zwei verborgenen Schichten erstellt, in dem alle Knoten mit einem hyperbolischen Tangens-Sigmoid ausgestattet waren; exp(-x2) Aktivierungsfunktion. Das etablierte Prognosemodell war ein vollständig vernetzter Algorithmus aus mehrschichtigen Perzeptronen.

Dementsprechend wurden die Daten aufgeteilt in (i) den Trainingssatz, der verwendet wurde, um den Fehler zu reduzieren und Gewichtungen an jedem Neuron des KNN festzulegen, (ii) den Validierungssatz, der verwendet wurde, um Hyperparameter abzustimmen und die Modellleistung während des Trainings bis zum Stillstand zu überwachen das ANN-Training und die Auswahl des besten Modells und schließlich (iii) der Testsatz, der zur Bewertung des endgültig trainierten Modells verwendet wurde, als externer Datensatz, der ausschließlich zum Testen der ANN-Robustheit und als endgültige Bewertung der Vorhersagekapazitäten diente; Dieser externe Datensatz wurde während des Modellentwicklungsprozesses nicht verwendet32.

Die ANN-Topologie wurde unter Verwendung mehrerer verborgener Schichten und Knoten untersucht. Die ANN-Topologie wurde als 3-h-1 bezeichnet. Drei Neuronen der getesteten Faktoren (dh Tyrosin, Saccharose und Inkubationszeit) stellen die Eingabeschicht dar. Die Ausgabeschicht besteht aus einem Neuron (Pilz-Melaninproduktion). Zwischen den beiden Eingabe- und Ausgabeschichten wurden zusätzliche versteckte Schichten erstellt, in denen ein Bereich von Neuronen von 3 bis 10 getestet wurde.

ANN wurde durch Versuch und Irrtum mit verschiedenen spezifischen Parametern trainiert (Lernrate, Lernmethode und die ideale Anzahl von Neuronen in der verborgenen Schicht). Für jede Versuchsphase wurde eine 10.000er-Tour verwendet. Anschließend wurde die optimale Architekturstruktur identifiziert, die zum besten Modell passt. Der Versuch-und-Irrtum-Prozess wurde angewendet, bis der niedrigste Fehler für den quadratischen Durchschnittsfehler (RASE) und den durchschnittlichen absoluten Fehler (AAE) auftrat. Zur Bewertung des Trainingsprozesses wurde auch der Variationskoeffizient (R2) zwischen den vorhergesagten und den tatsächlichen Werten verwendet.

Die Präzision des trainierten KNN wurde durch den Vergleich seiner vorhergesagten Ergebnisse mit den tatsächlichen Werten der Melaninproduktion bestimmt. Wenn die vorhergesagten Werte den tatsächlichen Werten nahe kamen oder ihnen entsprachen, wurde davon ausgegangen, dass die Vorhersagen des KNN hochpräzise waren. Diese Bewertung erfolgte normalerweise durch Berechnung eines statistischen Genauigkeitsmaßes, RASE, AAE und R2. Darüber hinaus wurde die Präzision des ANN visuell beurteilt, indem die vorhergesagten Werte mit den tatsächlichen Werten verglichen und die Verteilung der Datenpunkte untersucht wurden24.

Das optimale Niveau jedes der getesteten Faktoren, die die Melaninproduktion maximieren, wurde theoretisch mithilfe des angepassten Modells von BBD und ANN geschätzt und anschließend die erwartete Melaninproduktion geschätzt. Es wurde ein Verifizierungsversuch durchgeführt, bei dem die optimalen Einstellungen im Labor dreifach angewendet und mit den vorhergesagten Melaninwerten verglichen wurden, um die Genauigkeit beider Modelle zu testen.

Die Daten zur Melaninproduktion wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Der Entwurf der BBD-Matrix und die statistische Analyse wurden mit der Software JMP® Pro 17 (JMP®, SAS Institute Inc., Cary, NC) durchgeführt. Die Software wurde auch zur Durchführung maschineller Lernverfahren, zum Aufbau der ANN-Topologie und zur Implementierung der Trainings-, Validierungs- und Testverfahren verwendet.

Die Oberflächenmorphologie der Partikel des gereinigten Melaninpigments wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM)33 untersucht. Das goldbeschichtete Melanin, das zuvor lyophilisiert wurde, wurde mit einem SEM-Typ FEI Czech (Beschleunigungsspannung bei 25 kV) untersucht, der aus einer elektronenoptischen Säule, einem Vakuumsystem und Elektronik besteht. Die elektromagnetischen Linsen fokussierten die Elektronen zu einem feinen Punkt auf Melanin. Die Elektronenkanone mit Wolframfaden an der Spitze der Säule erzeugt den Elektronenstrahl, der auf der Melaninprobe auf einen feinen Punkt mit einem Durchmesser von weniger als 4 nm fokussiert wird. Dieser Strahl wird in rechteckigen Streifen abgetastet. Das Zusammensetzungsmuster wurde durch energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX)33 bestimmt, die mit SEM verbunden ist.

Die thermogravimetrische Analyse (TGA) wurde auf einem Perkin Elmer 400033 durchgeführt. Die Röntgenbeugungsmusteranalyse (XRD) wurde bei Pan Analytical Philips gemäß Khouqeer et al.34 durchgeführt. Zur Berechnung des Schichtabstands d wurde die Bragg-Gleichung (Gleichung 2) angewendet. Die durchschnittliche Korngröße (Kristallgröße) von Melanin wurde durch die Dedye-Schrerrer-Gleichung (Gleichung 3) geschätzt. Der Prozentsatz der Melaninkristallinität wurde entsprechend wie in (Gleichung 4) angegeben berechnet, wobei das Glassubstrat als Hintergrund berücksichtigt wurde.

wobei θ ≡ Beugungswinkel; m ≡ Beugungsordnung; λ ≡ Röntgenwellenlänge bei der betrachteten Beugung erster Ordnung (m = 1).

wobei λ die Wellenlänge (1,54) bezeichnet und FWHM ≡ Halbwertsbreite eines Beugungspeaks ist.

Ein einfaches Medium des hefeähnlichen Pilzes A. pullulans AKW wurde nacheinander über BBD- und ANN-Paradigmen für die Melaninproduktion optimiert. Das resultierende Melanin wurde anhand der SEM-, XRD-, EDX- und TGA-Eigenschaften charakterisiert.

Die Daten aus Tabelle 1 zeigen das Muster einer 15-Durchlauf-Designmatrix der verschiedenen Kombinationen der drei Variablen zusammen mit der experimentellen Melaninproduktion. Die erhaltenen Daten zeigten eine erhebliche Variation in der Melaninproduktion, wobei die beste Konzentrationskombination im Mittelpunkt (mittlere Konzentration) bei 5,69 ± 0,39 lag (Durchlauf Nr. 14).

Die relative Einzel-, Wechselwirkungs- und quadratische Bedeutung der getesteten Faktoren wurde unter Verwendung des P-Werts zum Vergleich quantifiziert. Das statistische Gewicht (Abb. 1) der getesteten Variablen wurde verwendet, um herauszufinden, welcher Prädiktor (Variable) am signifikantesten ist. Die wichtigste Variable hat den niedrigsten P-Wert. Ebenso war der Einzeleffekt von Inkubationszeit und Saccharose signifikant, wohingegen der Tyrosinspiegel keinen signifikanten Einfluss auf die Melaninproduktion zeigte. Bezüglich des Interaktionseffekts zeigte die Interaktion zwischen Tyrosin und den anderen beiden Faktoren (Inkubationszeit und Saccharosespiegel) einen nicht signifikanten Effekt. Letztendlich zeigten die drei Variablen einen signifikanten quadratischen Effekt.

Die relative Einzel-, Wechselwirkungs- und quadratische Bedeutung der getesteten Faktoren für die Melaninproduktion von A. pullulans AKW.

Die BBD-Daten wurden mittels ANOVA analysiert (Tabelle 2). Das Gesamtmodell ist signifikant (F-Wert = 42,4805) mit einem sehr niedrigen P-Wert (0,0003), andererseits ist der fehlende Anpassungsfehler statistisch nicht signifikant (P-Wert = 0,9206). Zusätzlich wurden andere Modellbewertungsstatistiken geschätzt, nämlich die R2-, angepassten R2- und Pridected-R2-Werte, die mit 0,9871, 0,9639 bzw. 0,9382 als extrem hoch befunden wurden.

Die Einzel-, Interaktions- und quadratischen Terme wurden ebenfalls von ANOVA untersucht. Neben Tyrosin waren Saccharose und Inkubationszeit von Bedeutung. Was die Interaktion zwischen Variablen betrifft, hat die Interaktion zwischen Saccharosespiegel und Inkubationszeit einen signifikanten Einfluss (P-Wert = 0,0073). Ansonsten zeigten alle quadratischen Terme einen signifikanten Effekt (P-Wert ≤ 0,05) auf die durch A. pullulans AKW vermittelte Melaninproduktion.

Folglich wurden die Regressionskoeffizienten der verschiedenen Terme des Modells berechnet und einer Polynomfunktion zweiter Ordnung unterworfen. Die vorhergesagte Melaninproduktion von A. pullulans AKW wurde durch die folgende Gleichung geschätzt:

Dabei ist Y die vorhergesagte Melaninproduktion, X1 Tyrosin (%, w/v), X2; ist Saccharose (%, w/v) und X3 ist die Inkubationszeit (h).

Wie man erkennen konnte, zeigten einige Modellterme (X1, X3, X1X3 und alle quadratischen Terme) negative Koeffizientenwerte, während die anderen positive Koeffizientenwerte aufwiesen. Allerdings wurde eine solche Gleichung für die Vorhersage der Melaninproduktionswerte verwendet, die den experimentellen Werten sehr nahe kamen und daher geringere Fehler aufwiesen. Basierend auf dem oben genannten Regressionsmodell wurden die von BBD vorhergesagten Werte geschätzt und mit den tatsächlichen Werten verglichen. Sowohl die geschätzten als auch die tatsächlichen Werte an jedem Datenpunkt zeigten eine hohe Übereinstimmung (Tabelle 2).

Ein mehrschichtiges Feed-Forward-KNN-Design wurde in einer vollständig vernetzten neuronalen Netzwerkplattform eingesetzt, um ein prädiktives KNN-Modell zu erstellen. Während des Versuch-und-Irrtum-Verfahrens wurde das Holdback-Ausbreitungsverhältnis bei 0,3333 verwendet, wodurch die BBD-Daten in zwei Sätze aufgeteilt wurden, wobei der erste Satz 10 Trainingsläufe zur Reduzierung von Vorhersagefehlern und zur Erstellung neuronaler Gewichte umfasste. Der zweite Satz besteht aus 5 Durchläufen zur Validierung, um das ANN-Training zu stoppen und das beste Modell auszuwählen. Nach mehreren Versuchen (jeweils 10.000 Touren) mit verschiedenen ANN-Anordnungen. Der Nachteil der ANN-Topologie wurde am besten bei einer quadratischen Lernrate von 0,2 mit zwei verborgenen Schichten mit jeweils 4 Knoten erreicht. Die Aktivierungsfunktion in allen Knoten beider verborgener Schichten des Netzwerks war hyperbolischer Tangens Sigmoid (NTanH). Als Ergebnis wurde eine vierschichtige ANN-Topologiestruktur (Abb. 2), bezeichnet als 3–4–4–1, als optimale Architektur ermittelt. Die Eingabeschicht besteht aus drei Neuronen (unabhängigen Faktoren): Tyrosin, Saccharose und Inkubationszeit. Die Neuronen-Ausgabeschicht stellt den Reaktionsfaktor der Melaninproduktion dar. Die beiden verborgenen Schichten zeigten eine überlegene Leistung, wenn sie die Aktivierungsfunktion von NTanH(4)NTanH2(4) in den verborgenen Neuronen nutzten.

Das ANN-Layout der Melaninproduktion von A. pullulans AKW. Das KNN enthält eine Eingabeschicht (drei Neuronen), zwei verborgene Schichten (jeweils 4 Neuronen) und die Ausgabeschicht (ein Neuron).

Um die Allgemeingültigkeit des Modells zu testen, wurden Versuche durchgeführt, um Fehler während des maschinellen Lernprozesses zu minimieren. Das ANN wurde trainiert, bis der R2-Wert maximiert war, wodurch ein Wert von 0,9857 für das Training und 0,9935 für die Validierung erreicht wurde.

Die Fähigkeit des trainierten Netzwerks, Ergebnisse genau vorherzusagen, wurde bewertet. Die vorhergesagten Werte für jeden Punkt der BBD-Daten wurden mithilfe des ANN berechnet (Tabelle 1). Die von ANN vorhergesagten Werte zeigten eine hohe Übereinstimmung mit den Untersuchungswerten und zeigten geringere Fehlerwerte als die des BBD-Modells.

Zur weiteren Bewertung beider Modelle wurde eine Restanalyse durchgeführt, um die Melaninproduktion von A. pullulans AKW vorherzusagen. Die aufgetragenen Residuen gegenüber den vorhergesagten Werten beider Modelle (Abb. 3) zeigten eine gleichmäßige Verteilung der Residuenpunkte, die eng und gleichmäßig um die 0-Achse verstreut waren, ohne Linearität aufzuweisen.

Diagramme von BBD und ANN, die die vorhergesagten Werte der Melaninproduktion im Vergleich zum Restwert und tatsächliche Daten zeigen.

Die vorhergesagten Modellpunkte im Vergleich zu den tatsächlichen experimentellen Werten beider Modelle (Abb. 3) wurden ebenfalls untersucht. Die Punkte beider Modelle liegen nahe der Linie der perfekten Vorhersage, was bedeutet, dass das Modell den tatsächlichen experimentellen Daten getreu nahekommen kann. Die lineare Regression zeigte jedoch, dass die Vorhersagen des ANN-Modells im Vergleich zum BBD-Modell deutlich näher an der Vorhersagelinie liegen.

Um die gegenseitigen und interaktiven Effekte zwischen jedem Variablenpaar zu kennen, wurden die 3D-Diagramme von BBD und ANN erstellt (Abb. 4). Die 3D-Diagramme stellten die Beziehungen zwischen den Variablen dar und zeigten einen Anstieg der Melaninproduktion, wenn sich die Konzentration der drei Variablen (dh Tyrosin, Saccharose und Inkubationszeit) dem optimalen Niveau näherte. Sobald jedoch der optimale Wert überschritten wurde, war ein Rückgang der Melaninproduktion zu beobachten. Es ist zu erkennen, dass höhere Werte der drei Variablen einen negativen Einfluss auf die Antwort haben.

Dreidimensionale Reaktionsoberflächendiagramme der Melaninproduktion von A. pullulans AKW, dargestellt als paarweise Kombination der getesteten Faktoren, wobei der dritte Faktor auf seinem mittleren (mittleren) Niveau konstant bleibt, basierend auf den BBD-Modellen (dargestellt durch rechts). Spalte) und ANN (dargestellt durch die linke Spalte).

Im Vergleich zu BBD zeigt ANN eine elliptische Kurve des Antwortflächendiagramms zwischen jedem Paar der getesteten Faktoren. Die 3D-Diagramme der BBD zeigten verschiedene Muster, und es konnte kein spezifischer Prototyp für jedes Paar der getesteten Faktoren erstellt werden, wobei die elliptische Kurve nur bei der Wechselwirkung zwischen Tyrosin- und Saccharosespiegeln auftrat. Im Allgemeinen zeigt das 3D-Diagramm, dass der Melaninproduktionsprozess um die zentralen Punkte des Versuchsaufbaus herum seinen Maximalwert erreichte.

Sowohl das BBD- als auch das ANN-Modell zeigten eine starke Vorhersagefähigkeit und geringere Residuen, was darauf hindeutet, dass sie tatsächliche Untersuchungsdaten genau anpassen und äußerst zuverlässige Vorhersagen treffen können. Um die Präzision dieser Modelle bei der Vorhersage der Melaninproduktion zu bewerten, wurden verschiedene statistische Parameter sowohl während des Trainings- und Validierungsprozesses als auch für die Gesamtmodelle bewertet (Tabelle 3). Basierend auf den Leistungsstatistiken war das ANN-Modell zuverlässiger als das BBD-Modell, bei dem der R2-Wert des gesamten ANN-Modells höher war als der des BBD-Modells. Andererseits verzeichneten die RASE- und AAE-Werte für das ANN-Modell niedrigere Werte als für das BBD-Modell.

Basierend auf den von beiden Modellen vorhergesagten Werten jedes Faktors wurde ein Verifizierungsexperiment durchgeführt, um den Modellierungsprozess zu bewerten, der in der Optimierungsstudie der Melaninproduktion verwendet wurde. Die vorhergesagten optimalen Bedingungen wurden separat durch BBD- und ANN-Modelle berechnet (Tabelle 3). Anschließend wurden die berechneten Werte der drei getesteten Faktoren experimentell validiert. Unter den theoretisch optimalen Bedingungen für die drei Variablen wurde die Reaktion der Melaninproduktion auf 10,555 bzw. 10,286 g/L für BBD bzw. ANN berechnet. Der Validierungsprozess ergab eine hohe Übereinstimmung mit der experimentellen Melaninproduktion und betrug 9,295 ± 0,556 g/L (BBD) und 10,192 ± 0,782 g/L (ANN). Es ist erwähnenswert, dass beide Modelle eine hohe Genauigkeit zeigten, ANN jedoch das BBD-Modell bei der Vorhersage der Melaninproduktion übertraf und einen Anstieg der Melaninproduktion um 9,7 % gegenüber BBD erzielte.

Unter den oben genannten Bedingungen wurde eine Massenproduktion von Melanin durchgeführt und anschließend zur Untersuchung der chemischen Struktur isoliert. Das gewonnene Melanin weist ein schwarzes, körniges Aussehen auf (Abb. 5). Im Allgemeinen ist Melanin ein Heteropolymer, das aus verschiedenen Untereinheiten besteht, was zu einer komplexen, amorphen und unlöslichen Molekülstruktur führt. Allerdings variiert die spezifische Zusammensetzung von Melanin je nach Quelle. Daher stehen traditionelle Methoden bei der Untersuchung ihrer Konstitution vor Herausforderungen. Daher wenden Forscher verschiedene Methoden an, um die Melaninstruktur zu untersuchen.

Eine Nahaufnahme von Melaninpartikeln, die von A. pullulans AKW biosynthetisiert werden.

Mithilfe der SEM-Analyse wurden die morphologischen Merkmale und die Architektur von Melanin untersucht. Die Analyse lieferte eine Topographie mit stark vergrößerten Bildern der Oberfläche der Melaninpartikel (Abb. 6). Die hierarchische Architektur der von A. pullulans AKW produzierten Melaninpartikel wurde mittels REM untersucht. Im Allgemeinen wurden die Partikel des Melaninpolymers in kleinen Zirkeln dargestellt und aggregiert.

REM-Aufnahmen von Melaninpigmentpartikeln, die von A. pullulans AKW produziert werden, bei den verschiedenen angegebenen Vergrößerungen.

Das hergestellte Melaninpigment wurde mittels XRD-Analyse analysiert, um seinen Materialtyp, seine Phase, seine kristallografischen Eigenschaften, seine chemische Zusammensetzung und seine physikalischen Eigenschaften zu untersuchen. Die Analyse basiert auf der konstruktiven Interferenz zwischen dem kristallinen Melanin und den monochromatischen Röntgenstrahlen. Das Diagramm der XRD-Analyse ist in Abb. 7 dargestellt und die Daten sind in Tabelle 4 dargestellt.

Die XRD-Analyse von Melanin.

Die EDX-Analyse als Analysetechnik wurde für Melaninpigmente implementiert, wie in Abb. 8 dargestellt. Die EDX-Analyse wurde angewendet, um die Elementaranalyse und die chemische Zusammensetzung des gereinigten Melaninpigments abzuschätzen.

Die EDX-Analyse des gereinigten Melaninpigments.

Die TGA wurde angewendet, um die thermischen Eigenschaften des gereinigten Melaninpigments zu untersuchen. Somit zeigten die in Abb. 9 gezeigten Ergebnisse den anfänglichen Massenverlust mit einem Peak bei 191,55 °C und einem Hinweis darauf, dass kein restliches adsorbiertes Wasser vorhanden war.

Thermogravimetrische Analyse von Melanin.

Der mikrobielle Fermentationsprozess zur Optimierung der Melaninproduktion ist ein vielversprechendes Verfahren, da mikrobielles Melanin umweltfreundlich, biokompatibel und wirtschaftlich ist. Darüber hinaus verfügt Melaninpolymer über ein breites Anwendungsspektrum, beispielsweise als bioaktives Molekül (Antioxidans, Sonnenschutzmittel und antimikrobielles Mittel) und könnte auch in funktionellen Biomaterialien als Sensibilisator in farbstoffsensibilisierten Solarzellen und als Rahmenpolymer für Metallnanopartikel verwendet werden. sowie bei der biologischen Sanierung metallverschmutzter Stellen und extrazellulärer elektronischer Materialien in mikrobiellen Brennstoffzellen3,35. Daher wurde die aktuelle Studie so organisiert, dass die Melaninproduktion durch den Endophyten maximiert wird. A. pullulans AKW unter Verwendung von BBD, während das ANN-Paradigma zum ersten Mal angewendet wurde.

Bezüglich des BBD-Paradigmas erreichten die Mittelpunkte der getesteten Faktoren die maximale Melaninproduktion von 10,811 ± 0,539 g/L (Durchlauf 14). Diese Ergebnisse zeigen, dass die ausgewählte Ebene jedes Faktors genau genug war. Wie aus den hohen F-Werten und niedrigen P-Werten in der ANOVA hervorgeht, zeigten die meisten Modellterme einen signifikanten Effekt und das Fehlen eines signifikanten Modellfehlers im Vergleich zum reinen Fehler, was die Genauigkeit der erhaltenen Daten und des experimentellen Designs bestätigte. Ein weiterer Grund: Wenn das Modell einen hohen F-Wert und einen nicht signifikanten Mangel an Anpassung aufweist, ist dies ein Hinweis auf eine ausreichende Fitness. Im Gegensatz zu Tyrosin weisen Inkubationszeit und Saccharosegehalt einen deutlichen Trend auf.

Im Allgemeinen wird der P-Wert verwendet, um die Signifikanz der Koeffizienten verschiedener Modellterme zu ermitteln. Das Signifikanzniveau bei der Alpha-Schwelle ≤ 0,05 gibt das Auftreten eines starken Zusammenhangs zwischen den getesteten Variablen und der Reaktion (Melaninproduktion) an25.

Der F-Test stellt keine Variationen (Nullhypothese, H0) zwischen den Modelltermen der Antwort auf. Stattdessen deutet die Ablehnung von H0 darauf hin, dass die Modellterme voneinander abweichen (Alternativhypothese, H1). Ein großer P-Wert (> 0,05) liefert starke Beweise für die Annahme von H0,13,36. Basierend auf der ANOVA wurde H0 verworfen, was die Bedeutung der getesteten Faktoren und die Zuverlässigkeit des Modells bei der Vorhersage der Melaninproduktion von A. pullulans AKW im untersuchten Raum bedeutet.

Damit das Modell zuverlässig ist, müssen außerdem R2, angepasstes R2 und Pridected-R2 ≥ 0,75 sein und relativ nahe beieinander liegen36. Das hohe R2 (0,9871), angepasste R2 (0,9639) und stolze R2 (0,9382) deuten auf ein gutes Regressionsmodell hin, außerdem ist die Beziehung zwischen den drei getesteten Variablen und der Melaninproduktion eng. Ein viel niedrigerer vorhergesagter R2 als R2 ist ein Warnsignal dafür, dass das Modell die Daten überpasst. Dies gilt nicht für unseren Fall, wo sie sehr nahe beieinander liegen25.

Basierend auf den geschätzten Koeffizienten wurden das optimale Niveau der drei Variablen und die Melaninreaktion vorhergesagt, die der tatsächlichen Melaninproduktion sehr nahe kamen, was einen zusätzlichen Beweis für die Genauigkeit des Modells und auch des Designraums nahelegt. Der negative Koeffizientenwert weist auf eine antagonistische Beziehung zwischen der Melaninproduktion und der variablen Konzentration im getesteten Designraum hin und umgekehrt. In mehreren Studien wurde jedoch berichtet, dass BBD die zuverlässigen Faktoren für die Melaninmaximierung identifiziert. Beispielsweise steigerte die Optimierung der Mediumzusammensetzung die Melaninproduktion durch Aspergillus fumigatus12.

Die optimale ANN-Topologiestruktur wurde als 3–4–4–1 bezeichnet und besteht aus drei Eingabeneuronen, einem Ausgabeneuron und zwei verborgenen Schichten mit jeweils 4 Neuronen, wobei die Aktivierungsfunktion von NTanH(4)NTanH2(4) verwendet wird.

Obwohl künstliche Intelligenz in der jüngsten wissenschaftlichen Forschung zunehmend an Bedeutung gewonnen hat, gab es bisher keine Arbeiten zur Modulation der mikrobiellen Melaninproduktion mithilfe von KNN. Diese Studie unterstützt diese Art der Modellierung.

Das ANN-Paradigma ist elastisch, kann gut vorhergesagt werden und ist in der Lage, jede nichtlineare Funktion zu lernen. Daher kann ANN aus jeder Art von Daten ein effizientes Modell generieren. Die ANN-Plattform nutzt einen Algorithmus für maschinelles Lernen zusammen mit einer flexiblen Funktion für die Eingabevariablen, um ein vollständig verbundenes mehrschichtiges Perzeptron aufzubauen. Diese Architektur verwendet indirekte Zwischenschichten, um die Zielmelaninproduktion von A. pullulans AKW vorherzusagen. Dieser Modellierungsansatz ist besser geeignet, wenn es nicht erforderlich ist, die Korrelation zwischen der Antwort und den Eingaben zu klären22,23,24.

Der Vergleich der vorhergesagten Vis-Restwerte der BBD- und ANN-Modelle zeigte eine gleichmäßige Verteilung entlang der 0-Achsen-Seiten. Um die diagonale Linie herum war eine dichte Ansammlung von Punkten zu erkennen. Dieses Verteilungsmuster bestätigt die hohe Präzision und Angemessenheit beider Modelle. Darüber hinaus ergaben die Residuen und die lineare Regressionsanalyse des ANN, dass sowohl die vorhergesagten als auch die tatsächlichen Punkte sehr nahe an der Linie der idealen Vorhersage lagen als die des BBD-Modells, was auf ein gut trainiertes ANN-Modell mit besserer Allgemeingültigkeit und höherer Präzision schließen lässt .

Die ovale Kurve des 3D-Diagramms sowohl für BBD als auch für ANN weist auf eine starke und klare Wechselwirkung zwischen jedem Paar der getesteten Faktoren hin, was auf eine sorgfältige Auswahl der Faktoren schließen lässt, und das Modell passt gut zum Design9.

Im Gegensatz zu ANN war der Prototyp von ANN jedoch nicht identisch mit BBD, da ANN komplexe nichtlineare Zusammenhänge zwischen den Inputs (Tyrosin, Saccharose und Inkubationszeit) und der Melaninproduktion erkennen kann. KNN kann verborgene Verbindungen zwischen Eingabe- und Ausgabevariablen identifizieren, auch wenn diese scheinbar keine explizite Korrelation haben. Dies ist auf die beiden Zwischenschichten im KNN zurückzuführen, die eine eindeutige Korrelation zwischen Eingaben und Ausgaben verwalten, anstatt einen direkten Weg zu finden, wie dies bei BBD der Fall ist. Somit ist ANN ein hervorragender Prognostiker, wenn die Beziehungen zwischen Output und Input nicht benötigt oder identifizierbar sind22,23,24,25.

Die Leistung beider Modelle wurde durch Messung von RASE und AAE bewertet. ANN zeigte für beide Fehlermessungen niedrigere Werte. Obwohl die Variation zwischen den Statistiken der einzelnen Modelle gering war, weist das ANN-Modell eine bessere Generalisierungsfähigkeit als BBD bei der Melaninproduktion auf. Die experimentelle Validierung der theoretischen Reaktion der Melaninproduktion, die von beiden Modellen berechnet wurde, zeigt die Gültigkeit beider Modelle.

ANN kann mit hoher Genauigkeit vorhersagen, da es die Nichtlinearität des Systems besser bewältigen kann als andere Modelle, die nur eine Berechnung in einem Schritt benötigen, um sich dem Ziel zu nähern22,23. Der Vergleich der Modelle von ANN und BBD erfordert eine gewisse Berücksichtigung der Unterschiede zwischen diesen beiden Ansätzen. ANN ist eine Art maschinelles Lernmodell, das das Verhalten des menschlichen Gehirns nachahmt, während BBD ein statistischer Ansatz ist, der zur Optimierung von Antwortvariablen auf der Grundlage experimenteller Designs verwendet wird. Um Modelle von ANN und BBD zu vergleichen, ist es daher erforderlich, die Vorhersagegenauigkeit, die Interpretierbarkeit des Modells, die Rechenkomplexität oder die einfache Implementierung klar zu definieren. ANN-Modelle gelten oft als Black-Box-Modelle, während BBD-Modelle in der Regel besser interpretierbar sind. Darüber hinaus umfasst die Modellierungstechnik von ANN den Aufbau einer Netzwerkarchitektur, die Einführung der verborgenen Schichten und Knotennummern in jeder Schicht, das Training und schließlich die Begründung und Authentifizierung des erhaltenen Modells. Somit ist das KNN-Paradigma vermutlich genauer, da es alle Datenpunkte von Experimenten umfasst22,23,24,25. Darüber hinaus ist die Robustheit und Generalisierungsleistung von ANN, insbesondere bei den neuen Daten, besser als beim BBD-Modell. Tatsächlich übertraf die KNN-Robustheit gegenüber Rauschen oder Ausreißern BBD22,23. Daher wurde die Entscheidung über die optimalen Bedingungen für die Melaninproduktion auf Basis des ANN-Modells getroffen.

Allerdings weist ANN einige Einschränkungen auf, wie zum Beispiel, dass aufgrund der vielen Iterationen mehr Rechenzeit für Training und Vorhersage benötigt wird und dass die Wichtigkeit und der Einfluss jedes Faktors im Modell nicht angezeigt werden, was es schwierig macht, Faktoren aus dem Modell zu entfernen oder zu vereinfachen Modell22,32.

Im Allgemeinen hängt die Regulierung der Melaninproduktion von bestimmten Enzymen ab, z. B. Tyrosinase mit essentiellen Sulfhydryl- und Lysylresten im aktiven Zentrum des Enzyms5. Andere Nährstoffe, z. B. Glucose, Pepton und Hefeextrakt, werden häufig im Nährmedium verwendet. Darüber hinaus zielten zahlreiche neuere Studien darauf ab, landwirtschaftliche Rückstände wie Maisquellwasser, Fruchtabfallextrakt und Weizenkleie für die Melaninproduktivität zu nutzen, um die Kosten zu minimieren und gleichzeitig eine hohe Melaninausbeute zu erzielen37. Darüber hinaus gibt es mehrere Studien, die eine Optimierung des Pilzmelanins erreichen, beispielsweise optimierten Ribera et al.38 die Melaninsynthese durch Armillaria borealis mit einer Ausbeute von 11,58 g/L in einem Medium, das Glucose, Hefeextrakt und Tyrosin enthielt, über 97 Tage. Eine andere Studie optimierte die Melaninsynthese durch den Pilz Aspergillus fumigatus (0,1 g/l) in einem Medium, das Dextrose und Pepton ohne Tyrosin enthielt, nach 10 Tagen12. Das optimierte Melanin wurde von Auricularia auricula (2,97 g/l) in einem Medium mit Laktose, Hefeextrakt und Tyrosin nach 8 Tagen gemeldet39. Dagegen produzierte Gliocephalotrichum simplex nach 6 Tagen in einem Medium, das Pepton und Hefeextrakt enthielt, Melanin mit 6,6 g/L40. In Tabelle 5 wurde jedoch die Produktivität der Organismen in früheren Studien in g/Tag berechnet und mit der aktuellen Melaninausbeute von A. pullulans AKW verglichen.

Im Vergleich zu diesen früheren Studien, die auf dem ANN-Paradigma basieren, produzierte unser Stamm (A. pullulans AKW) nach einer kürzeren Inkubationszeit (168 Stunden) auf einem einfachen Kartoffelinfusionsmedium eine geschätzte Menge Melanin (10,192 g/L). Tyrosin (0,329 %) und Saccharose (4,870 %). Das biotechnologische Potenzial des aktuellen Stamms bei der Melaninproduktion kann auf seine konstitutive Produktion durch den Pilz zurückgeführt werden, der als endophytischer Pilz entstanden ist.

Das endophytische Mikrobiom, auch Endosymbiont genannt, bezieht sich auf eine Vielzahl von Bakterien und/oder Pilzen, die in oder zwischen Zellen aller Pflanzenarten leben und sich entwickeln, ohne der Wirtspflanze zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus Schaden zuzufügen . Endophyten sind aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften ein neu entstandenes Interessengebiet9.

Wie BBD ergab, ist das aktuelle A. pullulans AKW hinsichtlich der Melaninproduktion unabhängig von Tyrosin. Unseren Ergebnissen zufolge produzierte Pseudomonas stutzeri innerhalb von 10 Stunden nach der Inkubation ohne Tyrosinsupplementierung Melanin (6,7 g/l)8. Im Gegensatz dazu fanden Surwase et al.47 heraus, dass L-Tyrosin bei 1,872 g/L die Melaninproduktion von Brevundimonas sp SGJ steigerte, nämlich 6,811 g/L. Im Allgemeinen hängen die Stoffwechselwege von Melanin vom Tyrosinase-Enzym ab, einem kupferabhängigen Biokatalysator, der an der ortho-spezifischen Hydroxylierung und anschließenden Oxidation von Monophenolen wie Tyrosin8 beteiligt ist, zusätzlich zum Laccase-Enzym, das die Oxidation einer breiten Palette von Monophenolen katalysiert Substrate wie Tyrosin, einschließlich Dihydroxyphenole und Chinone48. Darüber hinaus könnte der Mechanismus von Melanin über verschiedene Wege ablaufen, abhängig von der zufälligen Polymerisation einiger Bausteine, z. B. L-Tyrosin-Metaboliten von Indol-5,6-Chinon, 5,6-Dihydroxyindolcarbonsäure, 5,6- Dihydroxychinoncarbonsäure, Dopamin, Homogentisat und einige phenolische Vorläufer49.

Im Allgemeinen werden zwei Wege für die Produktion von mikrobiellem Melanin vorgeschlagen: Der erste ist der DOPA-Weg, der durch Tyrosinase und Laccase katalysiert wird und bei dem Tyrosin in L-DOPA und dann in Dopaquinon umgewandelt wird. Letzteres ist äußerst aktiv und oxidiert und polymerisiert spontan, um Melanin3 zu erzeugen. Im zweiten DHN-Weg wird Malonyl-CoA endogen erzeugt und dann durch Polyketidsynthasen katalysiert. Die sequentielle decarboxylierende Kondensation von fünf Malonyl-CoA-Molekülen erzeugt 1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalin, das Zyklen aus Reduktion und Dehydratisierung unterzogen wird Bei der Reaktion entstand 1,8-Dihydroxynaphthalin (DHN), das schließlich zu DHN-Melanin3 polymerisierte. Eine weitere Hypothese für die Melaninsynthese in Mikroorganismen legt die Bildung hydroxylierter aromatischer Moleküle während des katabolen Stoffwechsels nahe, z. B. Homogentisinsäure, die sich aufgrund eines enzymatischen Ungleichgewichts oder einer Unterbrechung ansammelt. Dieser Prozess erzeugt andere verschiedene Arten von Melanin50. Auf dieser Grundlage legen unsere Daten nahe, dass das aktuelle Melanin von A. pullulans AKW unabhängig von Tyrosin biosynthetisiert wird.

Es ist bereits bekannt, dass die Struktur von Melanin kompliziert ist und je nach Polymerisationsweg, Bausteinen und Enzymen verschiedene Formen aufweist. Melanin wird in mehrere Gruppen eingeteilt, darunter Eumelanin, Pyomelanin, Phäomelanin, Neuromelanin und Allomelanin8. Daher wurden die aktuellen Melanineigenschaften aufgeklärt.

Die SEM-Untersuchung der Melaninpartikelarchitektur bestätigte, dass die Partikel in kleinen Kompassen eine eindeutige Kristallform aufweisen. Dabei liegen die extrahierten pigmentierten Melaninpartikel mit einer durchschnittlichen Größe zwischen 150 und 160 nm vor. Im Allgemeinen zeigten die grafischen Melaninpartikel neben den in kleinen Zirkeln dargestellten Partikeln eine eindeutige Kristallform.

Das XRD-Spektrum der produzierten Melaninprobe zeichnet sich durch einen breiten Peak aus, der häufig in amorphen und ungeordneten Materialien wahrgenommen wird und bei etwa 23,1501 liegt. Die 2θ-Werte des Bragg-Reflexionspeaks wurden für sieben Beugungspeaks bei 10,0341, 10,6947, 11,7830, 23,1501, 23,4513, 31,5697 und 53,8896 gefunden, was mit der Spitzenbreite (°2Theta) von 0,0945, 0,0708, 0,1181, 0,09 übereinstimmt 45, 0,2362, 0,0472 und 0,1152, jeweils. Dieser Peak wird aufgrund der Röntgenbeugung an parallelen, ebenen Schichten aufgezeichnet.

Zur Berechnung des Schichtabstands d wurde die Bragg-Gleichung angewendet. Die berechneten Werte von d wurden für die Melaninprobe bei 8,81557, 8,27246, 7,51074, 3,84216, 3,79350, 2,83406 und 1,69994 gefunden. Diese Ergebnisse stimmen mit dem Literaturwert des Zwischenschichtabstands im Melanin-Stacked-Sheets-Modell überein. Die Qualität des gereinigten Melanins wurde durch die Nähe der Werte der Korngröße angezeigt.

Darüber hinaus wurde der Prozentsatz der Melaninkristallinität unter Berücksichtigung eines Glassubstrats als Hintergrund berechnet. Die Melaninprobe zeichnete die relativen Intensitätsprozentsätze bei 52,27, 66,76, 35,09, 100,0, 54,02, 61,82 bzw. 33,66 % für die sieben Beugungspeaks auf. Diese Ergebnisse bezüglich des Fehlens von Beugungsmustern im Zusammenhang mit der Kristallinität der Probe stimmen mit den Ergebnissen von Tarangini und Mishra43 sowie Xin et al.51 überein. Der Mangel an Kristallinität bezog sich auf die zuverlässigen physikalischen Eigenschaften von Melanin52.

Die EDX-Analyse ist insbesondere auf die Wechselwirkung der Röntgenanregung mit der analysierten Probe angewiesen. Die Ergebnisse zeigten die umfangreichsten Elemente mit den Superlativzusammensetzungen für Kohlenstoff- und Sauerstoffatome mit einem Gewicht von 54,38 bzw. 33,27 % und einem Atomprozentsatz von 65,40 bzw. 30,04 %. Unsere Ergebnisse stimmen in allen Aspekten perfekt mit den Ergebnissen von Tarangini und Mishra53 überein. In den Daten wurden auch kleinere Elemente in der Analyse mit einem Gesamtatomanteil von 4,55 % angegeben, was die Reinheit des produzierten Melanins bestätigte. Die quantifizierten Nebenelemente wurden als Natrium/K (0,18 %), Magnesium/K (0,12 %), Silizium/K (0,36 %), Schwefel/K (0,30 %), Chlor/K (1,85 %), Kalium/K abgeleitet (0,53 %), Kalzium/K (0,15 %) und Eisen/K (1,06 %). Die Variation in der Melaninzusammensetzung wird durch den Faktor der Änderung in der Zusammensetzung des Mediums gestützt. Ribera et al.38 haben angenommen, dass seltene Elemente wie Natrium, Kalium und Schwefel mit der Zusammensetzung des Wachstumsmediums zusammenhängen. Ein wichtiger vorläufiger Hinweis auf die Reinheit der Probe ist außerdem der erhöhte Kohlenstoffanteil neben dem Vorhandensein von Restpepton im Rohmelanin.

Ebenso bezog sich der Massenverlust bei 191,55 °C in der TGA-Analyse auf die Zersetzung von Pepton neben anderen restlichen Wachstumsmedien. Basierend auf den Literaturberichten54 zersetzten sich die aliphatischen Ketten oder Bestandteile unterhalb von 400 °C, die aromatischen Bestandteile begannen sich jedoch oberhalb von 400 °C zu zersetzen. In Bezug auf unsere Melaninprobe erfolgte die erste Zersetzung mit einer Gewichtsverlustrate von 33 % bei 191,55 °C. Die Ergebnisse aller Merkmale zeigten eine respektable thermische Stabilität von Melanin mit einer Gewichtsverlustrate von weniger als 20 % pro 800 °C. Diese Ergebnisse bezüglich der intensiven Resistenz von Melanin gegenüber thermischem Abbau stehen im Einklang mit der früheren Literatur55. Erwähnenswert ist, dass sich rohes Melanin unter Gewichtsverlust bei 325 °C zersetzt und den höchsten Massenverlust verzeichnet, während Melanin bei 350 °C zersetzt wird. Diese Ergebnisse wurden früher von Ribera et al.38 berichtet und durch unsere Ergebnisse bestätigt. Dementsprechend wurde der zweite Massenverlust bei 301,32 °C mit einem Massenverlust von weniger als 80 % und der dritte Massenverlust bei 440,65 °C ohne nennenswerten Massenverlust registriert. Folglich zeigte die Restmassemenge für die feste Melaninprobe keine wesentliche Varianz (78 %).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Optimierungsprozess von Melanin durch BBD- und ANN-Modelle durchgeführt wurde. L-Tyrosin, Saccharose und Inkubationsintervall waren die unabhängigen Variablen in der BBD-Matrix. Beide Modelle waren effizient bei der Bestimmung der besten Bedingungen für eine maximale Melaninproduktion. Das ANN-Paradigma zeigte jedoch eine Überlegenheit im Optimierungsprozess und ergab 10,192 ± 0,782 g/L. ANN hat die Melaninproduktion genau vorhergesagt und zeigte eine um etwa 9,7 % höhere Verbesserung der Melaninproduktion als BBD. Interessanterweise hat L-Tyrosin keinen signifikanten Einfluss auf den Optimierungsprozess von Melanin. Die Strukturmerkmale des produzierten Melanins wurden durch SEM-, XRD-, EDX- und TGA-Analyse ermittelt. Die SEM-Analyse zeigte die Aggregation der Melaninpartikel in kleinen Zirkeln. Die XRD-Analyse spezifizierte den Zwischenschichtabstand in den gestapelten Schichten, und der Mangel an Kristallinität wird als zuverlässiges physikalisches Merkmal bezeichnet. Die EDX-Analyse ergab den maximalen Atomprozentsatz für Kohlenstoff- und Sauerstoffatome bei 65,40 bzw. 30,04 %. Der Peptonabbau im TGA wurde mit einer Gewichtsverlustrate von 33 % bei 191,55 °C aufgezeichnet. Wichtig ist, dass unsere Ergebnisse somit die ersten sind, die die Melaninproduktion durch das Paradigma der künstlichen Intelligenz auf einem einfachen Medium unter Verwendung des neuen endophytischen A pullulans AKW optimieren. Die aktuelle Arbeit schlägt vor, neue Methoden für die Produktion von Melanin durch A. pullulans AKW in größerem Maßstab zu entwickeln und so dessen Beteiligung an verschiedenen Produkten zu ermöglichen. Darüber hinaus könnte eine Forschungsarbeit erstellt werden, die sich auf den aktuellen Stand der Genetik hinter der mikrobiellen Melaninproduktion sowie auf das Potenzial der Gentechnik zur Verbesserung der mikrobiellen Melaninproduktion konzentriert (Ergänzende Informationen S1 und S2).

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und den ergänzenden Dateien enthalten.

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Die Autoren danken dem Researchers Supporting Project mit der Nummer (RSP2023R114) der King Saud University, Riad, Saudi-Arabien.

Abteilung für mikrobielle Aktivität, Abteilung für Mikrobiologie, Forschungsinstitut für Böden, Wasser und Umwelt, Agrarforschungszentrum, Gizeh, 12619, Ägypten

WesamEldin IA Saber, Abeer A. Ghoniem und Mohammed S. El-Hersh

Abteilung für Botanik und Mikrobiologie, Fakultät für Naturwissenschaften, King Saud University, 11451, Riad, Saudi-Arabien

Fatimah O. Al-Otibi

Abteilung für Samenpathologie, Forschungsinstitut für Pflanzenpathologie, Agrarforschungszentrum, Gizeh, 12619, Ägypten

Weil M. Eldadamony

Abteilung für Biomedizin- und Umwelttechnik (BEE), Fluorotronics, Inc. California Innovation Corporation, San Diego, CA, 92037, USA

Farid Menaa

Abteilung für Gentechnik und Biotechnologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Mansoura, El-Gomhoria Street, Mansoura, 35516, Ägypten

Khaled M. Elattar

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Konzeptualisierung, WIAS, AG, FA-O., FM und KE; Datenkuration, ME-H., FM und KE; formale Analyse, AG, ME-H., NE, FM und KE; Untersuchung, AG, FA-O., NE und KE; Methodik, WIAS, AG, NE und KE; Projektverwaltung, FA-O.; Ressourcen, FA-O.; Software, WIAS; Aufsicht, WIAS, ME-H., NE und KE; Validierung, FA-O., ME-H., NE und FM; Visualisierung, WIAS, AG und FM; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, WIAS, AG, ME-H. und FM Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit WesamEldin IA Saber, Fatimah O. Al-Otibi oder Noha M. Eldadamony.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sabre, WIA, Ghoniem, AA, Al-Otibi, FO et al. Eine vergleichende Studie unter Verwendung der Response-Surface-Methodik und eines künstlichen neuronalen Netzwerks zur optimierten Melaninproduktion durch Aureobasidium pullulans AKW. Sci Rep 13, 13545 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40549-z

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Eingegangen: 25. Mai 2023

Angenommen: 12. August 2023

Veröffentlicht: 19. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40549-z

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